文章圍繞KRAS突變的胰腺癌展開研究，揭示了腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞與胰腺癌細胞相互作用促進腫瘤進展的機制，主要發(fā)現(xiàn)如下：

ERK活性與DUSP2的關(guān)鍵作用：KRAS突變雖啟動PanIN形成，但因存在衰老和凋亡信號難以高效發(fā)展為PDAC。單細胞RNA測序表明，腫瘤進展中ERK^activeDUSP2^low細胞亞群擴張，DUSP2表達改變可調(diào)節(jié)ERK活性，DUSP2抑制在KRAS突變背景下為癌細胞提供生存優(yōu)勢。

巨噬細胞的調(diào)控影響：巨噬細胞數(shù)量隨胰腺癌進展顯著增加，其可誘導胰腺癌細胞ERK磷酸化和DUSP2 表達降低，促進癌細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、增強遷移能力和anoikis抗性，使癌細胞獲得轉(zhuǎn)移能力。巨噬細胞與癌細胞相互作用還會促進淋巴血管生成和免疫逃逸。

關(guān)鍵信號軸及臨床意義：TIMP -1 - CD63信號軸維持ERK^activeDUSP2^low細胞狀態(tài)，巨噬細胞是TIMP - 1主要來源，臨床數(shù)據(jù)顯示TIMP - 1和CD63高表達與患者預后不良相關(guān)，該信號軸具有獨立預后價值，與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移及化療反應等密切相關(guān)。

研究背景：

胰腺癌是一種惡性程度高的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病機制復雜，預后較差。在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，致癌性KRAS突變扮演著關(guān)鍵角色，約90%的胰腺導管腺癌（PDAC）存在該突變，且在約30%的胰腺上皮內(nèi)瘤變（PanIN）中也能檢測到。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型里，Kras 激活雖能啟動PanIN的形成，但要發(fā)展成PDAC還需較長時間，且進一步進展需要抑癌基因如Ink4a/Arf、P53等的失活。同時，PDAC具有特的生物學特性，其細胞增殖并不突出，但早期就容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中的細胞間相互作用對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及藥物反應有著重要影響，其中巨噬細胞與腫瘤細胞的相互調(diào)節(jié)機制卻尚未明確?；谏鲜霰尘?，研究深入探究了KRAS突變的上皮細胞如何獲得逃避衰老和免疫清除的能力，進而發(fā)展為晚期PDAC。

研究方法：

細胞實驗：培養(yǎng)胰腺癌細胞系、單核細胞系等，制備條件培養(yǎng)基，進行細胞共培養(yǎng)、遷移實驗、活力檢測等，通過RT-qPCR和Western blot分析基因和蛋白表達。

動物實驗：建立基因工程小鼠模型，進行胰腺原位和門靜脈注射實驗，觀察腫瘤進展，對腫瘤組織進行免疫組化染色。

臨床樣本分析：獲取胰腺癌患者腫瘤標本，進行單細胞或批量RNA測序、數(shù)字空間分析，驗證臨床相關(guān)性。

主要研究結(jié)果：

1. 持續(xù)的ERK活化可能是KRAS突變PDAC進展的驅(qū)動力

通過對正常和Kras突變胰腺（KrasLSL?G12D/+, Pdx11Cre/+ ，KC）的免疫組化染色，發(fā)現(xiàn) PanIN區(qū)域存在大量衰老和凋亡信號，這解釋了Kras 突變無法高效驅(qū)動PanIN發(fā)展為 PDAC的原因。此外，對正常、早期和晚期胰腺腫瘤進行單細胞RNA測序，結(jié)果顯示隨著腫瘤進展，細胞群體發(fā)生顯著變化，如成纖維細胞、巨噬細胞和上皮細胞比例增加，而T和 B細胞比例減少。上皮細胞進一步細分為八個亞群，其中E1和E2亞群的比例在腫瘤進展過程中逐漸增加，表明這兩個亞群的細胞在腫瘤發(fā)展中起著重要作用。另外，分析表明E2亞群在更晚期的腫瘤階段富集，且表達Krt18和Krt19，而E1亞群仍保留較高水平的腺泡基因表達（Amy1/Amy2a2）?；虮倔w富集分析顯示，E1亞群主要參與細胞對炎癥、離子和應激的反應，提示該群體受到外部刺激；E2亞群則富集在上皮增殖、ERK信號傳導、遷移和細胞骨架組織等途徑，表明其在腫瘤進展中與細胞的增殖和遷移密切相關(guān)。

圖1 Kras突變上皮細胞的E2子集隨著腫瘤的進展而擴大。

隨后分析了KRAS突變的胰腺癌中，ERK活性與DUSP2表達之間的關(guān)系，以及它們在腫瘤進展中的作用機制。對早期和晚期胰腺癌進行單細胞RNA測序結(jié)果顯示，隨著腫瘤進展，成纖維細胞、巨噬細胞和上皮細胞比例上升，T和B細胞比例下降。在上皮細胞的三個亞群（C1-Epi、C14-Epi和C15-Epi）中，C15-Epi在早期和晚期都表現(xiàn)出MYC和E2F靶通路的顯著富集。此外，DUSP家族成員在免疫細胞中表達水平較高，且DUSP1、DUSP2、DUSP4 和DUSP6在不同細胞類型中表達各異。進一步分析上皮亞群中DUSP的表達，發(fā)現(xiàn)只有 DUSP2在晚期C15-Epi中的表達降低，這表明DUSP2表達下調(diào)可能與ERK活性上調(diào)有關(guān)；隨后在PANC-1胰腺癌細胞中轉(zhuǎn)染DUSP2及磷酸酶失活的DUSP2，以及敲低DUSP2進行實驗。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染DUSP2可降低ERK活性，而敲低DUSP2則增加ERK磷酸化。在基因工程小鼠模型中，Kras 突變背景下敲除DUSP2，會導致更嚴重的胰腺病變，且凋亡細胞減少。這些實驗結(jié)果充分證實DUSP2表達改變足以調(diào)節(jié)ERK活性，DUSP2抑制在Kras突變背景下為癌細胞提供生存優(yōu)勢。

圖2 胰腺癌中細胞群體特征、相關(guān)基因表達差異及DUSP2對ERK活性的調(diào)控研究。

2. 巨噬細胞對胰腺癌細胞中ERK活性和DUSP2表達的調(diào)控作用及其與腫瘤進展的關(guān)系

通過scRNA測序發(fā)現(xiàn)胰腺癌微環(huán)境中巨噬細胞從早期到晚期顯著增多。用巨噬細胞條件培養(yǎng)基MCM處理PANC-1細胞或讓單核細胞與癌細胞共培養(yǎng)，可使ERK磷酸化增加、DUSP2表達降低，說明癌細胞與單核細胞相互作用能調(diào)節(jié)ERK/DUSP2軸。MCM處理后，ERK快速激活且至少持續(xù)2天，DUSP2降低在ERK激活后出現(xiàn)，ERK抑制劑可逆轉(zhuǎn)相關(guān)變化。在Kras突變小鼠模型中，ERK1/2磷酸化區(qū)域與腫瘤晚期及巨噬細胞相關(guān)，DUSP2敲除會增強pERK和周圍巨噬細胞數(shù)量，證實巨噬細胞可誘導胰腺癌細胞ERK持續(xù)激活。

圖3巨噬細胞誘導胰腺癌細胞ERK持續(xù)激活

3. 胰腺癌癥細胞ERK^activeDUSP2^low軸抑制E-cadherin和促進轉(zhuǎn)移能力

經(jīng)MCM處理的PANC-1細胞呈現(xiàn)紡錘形，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，運動能力增強，E-cadherin 表達顯著降低。抑制ERK磷酸化可逆轉(zhuǎn)E-cadherin的表達，表明MCM通過ERK激活抑制E-cadherin。DUSP2敲低細胞表現(xiàn)出與MCM處理相似的表型，且MCM處理的細胞anoikis 抗性（失巢凋亡抗性，細胞抵抗因脫離細胞外基質(zhì)而引發(fā)程序性死亡的能力）增加。此外，將KPPC細胞注入小鼠體內(nèi)，MCM處理的KPPC細胞能形成更具侵襲性的腫瘤并發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，說明MCM處理使胰腺癌細胞獲得轉(zhuǎn)移能力，而這與E-cadherin的變化密切相關(guān)。

圖4 MCM表觀遺傳學修飾抑制E-cadherin表達并促進轉(zhuǎn)移。

4. ERK^activeDUSP2^low腫瘤細胞加劇巨噬細胞介導的腫瘤惡性表型

將MCM處理的腫瘤細胞注入小鼠體內(nèi)，腫瘤更大且部分出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，同時E-cadherin受抑制，VEGF-C表達增加，促進淋巴血管生成。細胞Chat分析顯示腫瘤細胞上調(diào)PD-L1信號以逃避免疫監(jiān)視，DUSP2-KD細胞中PD-L1表達增加，與巨噬細胞共培養(yǎng)時進一步增強。用KPPC小鼠來源的癌細胞實驗發(fā)現(xiàn)，與巨噬細胞共培養(yǎng)可誘導腫瘤細胞ERK磷酸化和PD-L1表達，使其逃避T細胞殺傷，揭示巨噬細胞能幫助癌細胞實現(xiàn)免疫逃逸。

圖5 巨噬細胞促進ERK^activeDUSP2^low腫瘤細胞的淋巴管生成和免疫逃逸。

5. ERK^activeDUSP2^low信號受TIMP-1-CD63軸持續(xù)活化

通過細胞因子陣列分析，確定TIMP-1可能是維持癌細胞ERK^activeDUSP2^low狀態(tài)的關(guān)鍵因子。敲低CD63后，MCM誘導的ERK磷酸化維持能力下降，表明TIMP-1-CD63信號介導了ERK的持續(xù)激活。臨床樣本分析顯示，免疫細胞中的TIMP-1與癌細胞中的CD63呈正相關(guān)，高表達的TIMP-1和CD63與患者預后不良相關(guān)，且該關(guān)聯(lián)在M2巨噬細胞存在時更顯著。

圖6 巨噬細胞與ERK^activeDUSP2^low上皮細胞之間的信號相互作用。

6. PDAC隊列中TIMP-1和CD63相互作用的臨床相關(guān)性

對人PDAC樣本進行數(shù)字空間分析，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中TIMP-1的主要來源，且 TIMP-1在M2巨噬細胞中高表達。進一步分析發(fā)現(xiàn)，免疫細胞中的TIMP-1與癌細胞中的 CD63呈正相關(guān)。對97例胰腺癌樣本的研究顯示，TIMP-1和CD63高表達與患者無病生存期差相關(guān)，具有獨立預后價值，且與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移及化療反應等相關(guān)。在不同隊列分析中，TIMP-1/CD63軸與M2巨噬細胞signature結(jié)合時，對預后判斷意義更顯著，凸顯其在影響疾病結(jié)局中的重要性。

圖7 Mac-TIMP-1和Epi-CD63的表達預測PDAC不良預后。

創(chuàng)新點與不足之處

研究發(fā)現(xiàn)TIMP-1-CD63信號軸在調(diào)控KRAS突變的胰腺癌細胞的免疫逃逸和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，拓展了對胰腺癌發(fā)病機制的理解，為后續(xù)研究提供了新的靶點和方向。通過單細胞RNA測序等技術(shù)，鑒定出ERK^activeDUSP2^low細胞亞群在胰腺癌進展中的重要作用，揭示了其與巨噬細胞相互作用的機制，為深入理解胰腺癌的發(fā)展過程提供了新的細胞層面的證據(jù)。

文章雖在KRAS突變胰腺癌研究上取得成果，但仍可能存在局限：

實驗模型方面：小鼠模型與人類胰腺癌存在差異，基因背景、腫瘤微環(huán)境及對治療反應不同，限制了研究成果向臨床的轉(zhuǎn)化。

研究范圍：僅聚焦特定細胞亞群和信號通路，忽略了腫瘤微環(huán)境中其他細胞和分子的影響，且未充分探討性別、年齡等因素對胰腺癌進展的作用。此外，臨床樣本量偏小且存在隊列差異，影響研究結(jié)論的普適性和可靠性。

作用機制：雖揭示了關(guān)鍵信號軸，但對其上下游調(diào)控機制及相互作用細節(jié)了解不足，如TIMP -1如何精確調(diào)節(jié)DUSP2的表達，以及CD63下游的信號傳導通路具體細節(jié)還不清楚。此外，臨床樣本量小且存在隊列差異，影響研究結(jié)論的普適性和可靠性。

原文鏈接：https  ://  molecular-cancer.biomedcentral.  com/articles/10.1186/s12943-024-02207-4